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pcr-技术-英国twistdx inc公司开发恒温扩增rpa

英国twistdx inc公司开发的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)--被称为是可以替代pcr的-技术，目前新的等温扩增检测技术。以此为基础的twistamp? -扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子-。该技术对硬件设备的要求很低，-适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御和农业等领域。

常规pcr必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而pcr仪本质上就是一个控制温度升降的设备。rpa反应的适宜温度在37°c - 42°c之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快pcr的速度。此外，由于不需要温控设备，rpa可以真正实现便携式的快速-。

据介绍，rpa检测的灵敏度-，能够将痕量的-(尤其是dna)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且rpa还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取-的实地检测。

rpa不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条(侧流层析试纸条lfd)读取结果。

目前，twistamp? 试剂盒的扩增子长度在500bp以内。不过，经过-优化的rpa扩增，也可以生成更长的扩增产物，或者减慢扩增速度(便于定量)，甚至在-的温度下进行反应。

twistdx相关问题

1. rpa能实现多重化吗?

可以。rpa技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要-设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，rpa反应的引物总量(nmol)尽量不要超标太多。如果在-一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。

2.能否对模板进行定量?

可以。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，-对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添-间进行控制。因为镁离子一一旦进入体系，rpa反应就会开始。此外，较慢的扩增过程有助于更-的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢rpa的反应速度。

3能否进行荧光终点分析?

可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光，荧光增强意味着发生了扩增。

4能否支持生物素或荧光标记的寡核苷酸?

支持。在rpa反应中，连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。据悉还没有发现任何差异。

5跑胶前需要回收rpa产物吗?

需要。rpa反应中的物质会干扰琼脂糖电泳，如果不进行产物回收，跑出来的带会出现拖尾。

twistdx试剂盒

常见的是-试剂盒。一般多为qpcr方法的，也有多重pcr的。检测新型冠状-特异序列的方法常见的是荧光定量pcr聚合酶链式反应。因pcr反应模板仅为dna，因此在进行pcr反应前，应将新型冠状--rna逆转录为dna。在pcr反应体系中，包含一对特-引物以及一个taqman探针，该探针为一段特-寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；如反应体系存在靶序列，pcr反应时探针与模板结合，dna聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条dna链，就有一个荧光分子产生。荧光定量pcr仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数ct值与--浓度有关，--浓度越高， ct值越小。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。